Las células T CD8+ citotóxicas se dirigen a los antígenos citrulinados en la artritis reumatoide

CD8⁺ Las células T en sangre ACPA+ RA expresan activación y marcadores citotóxicos

Primero realizamos un análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con AR ACPA+, pacientes con AR ACPA y controles sanos (HC) (Figura 1 complementaria y Tabla 1 complementaria). Encontramos que el porcentaje de CD8⁺ Los linfocitos T aumentan en la sangre de AR ACPA+ en comparación con los pacientes con AR ACPA o HC (Fig. 1a) y se correlacionan positivamente con los niveles séricos de anticuerpos anti-CCP (Fig. 1b). Detectamos CD8⁺ Las células T en la sangre ACPA + RA expresan en gran medida los marcadores de activación y citotóxicos CD69 y GPR56 (Fig. 1c, d), y mostraron una expresión reducida de los receptores inhibidores PD-1 y TIM3 en comparación con los HC (Suplementario Fig. 2a). el CD8⁺TCRγδ⁺ La población de células T aumentó significativamente tanto en ACPA+ como en ACPA− RA en comparación con la sangre HC (Fig. 1e). Además, la frecuencia de CD8⁺ Las células T que expresan granzima B (GzmB) en sangre ACPA+ RA aumentaron significativamente en comparación con las HC, mientras que la proporción de granzima K (GzmK)⁺CD8⁺ Las células T fueron similares entre los grupos (Fig. 1f).

Luego comparamos la memoria CD8⁺ Subconjuntos de células T, incluidos naïve (N), memoria central (CM), memoria efectora (EM) y memoria efectora activada CD45RA⁺ (EMRA) basado en la expresión de CCR7 y CD45RA. CD8⁺ Las células T tanto en ACPA+ como en ACPA− RA exhibieron una menor proporción de células T vírgenes y mayores niveles de células EMRA en comparación con las HC (Fig. 1g). La proporción de CD8⁺ Células EMRA que expresan KIR2DL3, que es un marcador de CD8 regulador⁺ células T³⁸ y CD69 aumentó significativamente tanto en ACPA+ como en ACPA− RA en comparación con los HC (Fig. 2b, c complementarias). Además, encontramos que no solo la proporción de CD8 total⁺ Células T, GzmB o KIR2DL3 que expresan CD8⁺ Células T o EMRA CD8⁺ subconjuntos de células T, pero también los recuentos absolutos de células de estos CD8 citotóxicos activados⁺ células, aumentan en sangre ACPA + RA en comparación con HC (Fig. 3 complementaria). Juntos, estos resultados demuestran que los CD8 sanguíneos de la AR⁺ Las células T expresan un aumento de CD69, GPR56 y granzima B, y están sesgadas a una memoria efectora activada (CD45RA⁺ CCR7^–) fenotipo.

La transcriptómica unicelular identifica múltiples CD8 citotóxicos activados⁺ Subpoblaciones de células T en ACPA+ RA en comparación con HC

Para una caracterización en profundidad de CD8⁺ Células T en AR, realizamos la secuenciación del transcriptoma de una sola célula (y TCR) de CD8⁺ Células T en sangre de ACPA+ RA y HCs. Analizamos todos los conjuntos de datos del transcriptoma para seleccionar CD8⁺ Células T que usan agrupación no supervisada de CD3 total⁺ Células T para definir el CD8⁺ Grupos de células T basados ​​en la expresión de la proteína CD8A usando anticuerpos CITE-seq y niveles de ARN de CD8A y CD4 (CD4 + Células T usando agrupamiento no supervisado. Anotamos estos grupos en función de su expresión de marcadores de subconjuntos canónicos y definimos los siguientes grupos de CD8⁺ Células T en sangre ACPA+ RA y HC: Ingenuo, Memoria, TCRgd⁺, GZMK⁺, GZMB⁺ GNLY⁺, GZMB⁺ KIR⁺ y CCR6⁺ CD161⁺ (Fig. 2a, b, Fig. 4b complementaria y Tabla complementaria 2). Estas subpoblaciones eran transcripcionalmente distintas según el análisis de genes expresados ​​​​diferencialmente (valor de P adj. 0.8) (Fig. 4c complementaria). Curiosamente, detectamos KIR3DL2, KIR2DL3 o KIR3DL1-expresando CD8⁺ Las células T expresan varios marcadores citotóxicos que incluyen GZMB, GNLY o PRF1 como se publicó anteriormente³⁸.

Analizamos las diferencias en la distribución de CD8⁺ Células T en los 7 grupos identificados. Los pacientes con AR ACPA+ mostraron un aumento en la proporción de grupos múltiples que incluyen GZMB⁺ KIR⁺, TCRgd⁺ y, mientras que la proporción de CD8⁺ células T en el CCR6⁺ CD161⁺ el grupo disminuyó en ACPA + RA (Fig. 2c).

Luego analizamos las poblaciones de CD8 que expresan granzimas⁺ Células T entre ACPA+ RA y HC usando análisis de genes expresados ​​diferenciales pseudobulk (DEG). Realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para identificar las vías representadas por los DEG. Los DEG expresados ​​por el GZMB⁺ los grupos de ACPA+ RA representaban rutas que incluyen citotoxicidad mediada por células T, citotoxicidad mediada por leucocitos y muerte celular; mientras que, en contraste, los DEG expresados ​​por el GZMK⁺ los grupos de ACPA + RA representaron vías que incluyen la señalización del receptor de células T y la diferenciación de células T gamma delta (Fig. 2d). Además, el análisis de enriquecimiento GO indicó un enriquecimiento significativo de la citotoxicidad de las células T y las vías de destrucción celular en ACPA+ RA GZMB⁺ clúster (valor adj.P GZMB⁺ clúster, mientras que el ACPA+ RA GZMK⁺ el grupo no fue significativo entre ACPA + RA y HC (Fig. 2e).

Análisis de los grupos que expresan granzimas (GZMB⁺ y GZMK⁺), demostró que GZMB⁺ los grupos expresan niveles significativamente mayores de los genes relacionados con la citotoxicidad de las células T GNLY, PRF1, CTSC y CD226 en ACPA+ RA en comparación con HC, mientras que el nivel de expresión de estos genes es similar en GZMK⁺ grupo entre ACPA + RA y HC (Fig. 2f, g). Curiosamente, el nivel de expresión pseudobulk de todos estos genes fue mayor en el GZMB⁺ agrupaciones en comparación con GZMK⁺ clúster en ACPA+ RA. Estos resultados demuestran prominente GZMB-expresando CD8⁺ Las subpoblaciones de células T expresan programas transcripcionales de citotoxicidad de células T en AR ACPA+ en comparación con HC.

Identificación de CD8 expandido clonalmente⁺ linajes en ACPA+ RA en comparación con HC

Además, realizamos un análisis integrado de los datos de secuenciación transcriptómica y TCR de una sola célula para analizar los linajes clonales dentro de los 7 CD8.⁺ grupos de células T. Definimos clonotipos expandidos basados ​​en dos o más células T que expresan el mismo emparejado TCRα y TCRβ cadenas De los ~10,000 TCR±Î² pares obtenidos, identificamos un rango de tamaños de linaje clonal que incluye Grande (miembros del linaje clonal, X > 20), Mediano (20 > X a‰§â€‰5) y Pequeño (5 > X a‰§2) linajes. CD8⁺ Las células T en ACPA+ RA contenían una mayor proporción de células expandidas clonalmente que HC (Fig. 3a), lo que sugiere que CD8⁺ Las células T podrían expandirse clonalmente en respuesta a antígenos específicos en la AR. El CD8 expandido clonalmente⁺ Las células T se ubicaron principalmente en grupos efectores/citotóxicos, incluido el GZMB⁺ GNLY⁺, GZMB⁺ KIR⁺TCRgd⁺y GZMK⁺ racimos (Fig. 3b). Por el contrario, observamos que los grupos de ingenuos y de memoria consisten predominantemente en singletons (Figura complementaria 5a, b). La proporción de gran expansión GZMB⁺ GNLY⁺ fue considerablemente mayor en ACPA+ RA (~50 % del total de clones) que en HC (~30 % del total de clones), lo que sugiere GZMB y GNLY-expresando CD8⁺ Las células T podrían representar células citotóxicas que responden a un autoantígeno (Fig. 3c). Por el contrario, el GZMK⁺ Los grupos exhibieron una proporción relativamente menor de clones expandidos en comparación con los GZMB⁺ grupos en ACPA + RA (Fig. 3c). Además de la proporción, la frecuencia absoluta de clones ampliamente expandidos en GZMB⁺ GNLY⁺ clúster fue mayor que en GZMK⁺ grupo en ACPA+ RA (Fig. 3d).

Además, observamos CD8 expandido clonalmente⁺ Las células T expresaron mediadores citotóxicos que incluyen GZMA, GZMB, GNLYy PRF1así como marcadores de células migratorias que incluyen CX3CR1 y CCL4 (Figura 3e). A partir de nuestros datos de citometría de flujo (Fig. 1f), demostramos que el nivel de GZMB la expresión está aumentada en CD8⁺ Células T de ACPA+ RA en comparación con HC, incluso en las células grandes expandidas clonalmente. Por otro lado, la fuerte expresión de GZMK se detectó en clones expandidos medianos y pequeños o en algunos singletons. Los singletons no expresan genes citotóxicos y migratorios, lo que sugiere que la población de CD8 responde a antígenos⁺ Las células T expresan altamente genes que matan células. Además, el análisis de la expresión de los genes TCR Vβ y Jβ mostró una mayor frecuencia de expresión de ciertos TRBV y TRBJ genes, incluyendo TRBV5-4–TRBJ2-3 y TRBV29-1—TRBJ2-7 en ACPA + RA en comparación con HC (Figura complementaria 5c, d). Juntos, estos resultados indican CD8 expandido clonalmente⁺ Las células T en la sangre ACPA+ RA expresan genes que codifican mediadores citotóxicos, incluidos GZMB.

Los antígenos citrulinados estimulan el CD8 sanguíneo ACPA+ RA⁺ Las células T proliferan de manera dependiente de HLA clase I

Dadas las proporciones aumentadas y las expansiones clonales de CD8 que expresa granzima B⁺ Células T en sangre ACPA+ RA, investigamos si ACPA+ RA CD8⁺ Las células T son reactivas a los autoantígenos citrulinados candidatos. Primero medimos los niveles del marcador de proliferación Ki-67 en PBMC ACPA+ RA estimuladas con vimentina citrulinada (cit-vimentina) o proteína vimentina nativa. La cit-vimentina es una proteína citrulinada presente en la articulación de la AR^22,39. Utilizamos anticuerpos anti-CD3/CD28, proteína nuclear (NP) del virus de la influenza y/o citomegalovirus (CMV) pp65 como controles positivos. La estimulación con cit-vimentina, pero no con vimentina nativa, aumentó significativamente la frecuencia de Ki-67⁺ células entre CD8⁺ Células T (Fig. 4a). Además, el bloqueo de anticuerpos de la presentación de antígenos mediada por HLA clase I usando anticuerpos anti-CD8 o HLA clase I (HLA I) inhibió la expresión de Ki-67 inducida por cit-vimentina (Fig. 4a), lo que indica una presentación restringida de cit por HLA clase I. CD8 mediado por vimentina⁺ Activación de células T. Confirmamos que tanto cit-vimentin como influenza NP fueron endocitados por HLA clase I que expresa CD11c⁺ células presentadoras de antígenos (APC) (Fig. 6a, b complementarias). En un experimento paralelo, cit-vimentina pero no vimentina nativa también estimuló ACPA+ RA CD4⁺ Células T para expresar Ki-67 (Fig. 4b).

Para caracterizar aún más RA CD8⁺ Respuestas de células T a cit-vimentina, ACPA+ RA CD3⁺ Las células T se tiñeron con un colorante de proliferación celular y se cocultivaron con células dendríticas derivadas de monocitos (MoDC) cargadas con cit-vimentina o vimentina nativa. Cit-vimentina indujo una proliferación significativa tanto de CD8⁺ y CD4⁺ Células T medidas por aumento de colorante^bajo CD8⁺ o CD4⁺ Las células T, mientras que la vimentina nativa no indujo la proliferación, y el bloqueo mediado por anticuerpos de la presentación de antígenos mediada por HLA clase I bloqueó la proliferación (Fig. 4c, d). Para determinar si cit-vimentin puede activar directamente CD8⁺ Células T para proliferar sin CD4⁺ Ayuda de células T, CD8⁺ Las células T se aislaron y cocultivaron con cit- o vimentina nativa. CD8⁺ Las células T proliferaron en respuesta a cit-vimentina, y el bloqueo de HLA clase I inhibió significativamente la proliferación inducida por cit-vimentina (Fig. 4e). Por el contrario, la cit-vimentina no indujo la proliferación de ACPA− RA o HC CD8⁺ Células T (Fig. 7a–c complementaria). Colectivamente, estos resultados muestran CD8⁺ Las células T en sangre ACPA+ RA exhiben respuestas proliferativas a cit-vimentina en una forma restringida de HLA clase I.

CD8 reactivo con citrulina⁺ Las células T en ACPA+ RA se expanden clonalmente y expresan altamente moléculas citotóxicas y de tráfico sinovial

Para definir si CD8⁺ Las células T se someten a una expansión clonal en respuesta a antígenos citrulinados, utilizamos secuenciación de ARN y TCR de células individuales. Realizamos estimulación antigénica de CD4 en sangre⁺ y CD8⁺ Células T de 3 pacientes con AR ACPA+ con vimentina nativa/citrulinada o proteínas H3 como se describe en la Fig. 4c, d. Identificamos 17 grupos distintos de CD4⁺ y CD8⁺ Células T, con los grupos 3, 6, 10 y 14 compuestos por CD8⁺ Células T que expresan granzimas (Fig. 8a-c complementaria). La mayoría de las células expandidas clonalmente grandes y medianas expresaron CD8 y no CD4 (Fig. 9a complementaria). Más, CD8⁺ los linajes clonales expresaron moléculas citotóxicas y de quimiocinas (CD57, GZMH, GNLY, GZMB y CCL4), mientras que la CD4⁺ las células representaban linajes clonales más pequeños y singletons que expresaban fenotipos ingenuos (CD62L, CCR7 e IL-7Ra) (Fig. 9b complementaria).

Mostramos que los antígenos citrulinados estimulan la expansión clonal de las células T (Fig. 10a complementaria). Mientras que la mayoría de RA CD3⁺ Las células T exhibieron puntajes altos de inflamación, los puntajes de citotoxicidad y proliferación solo aumentaron con CD8⁺ Células T contenidas en los grupos reactivos con citrulina 3, 6, 10 y 14 (Fig. 10b complementaria). A continuación, aislamos CD8^altoCD4^bajo Células y reagrupadas para un análisis en profundidad de CD8 reactivo con citrulina.⁺ Células T (Fig. 11a complementaria). Dentro del CD8⁺ Los grupos de células T, los antígenos citrulinados indujeron grandes linajes clonales del grupo 0 que expresaban puntuaciones altas de tráfico citotóxico y sinovial (Fig. 5a-c). Usando anticuerpos CD45RO y CD45RA CITE-seq, identificamos que el grupo 0 reactivo con citrulina muestra un fenotipo de memoria activada o subconjunto TEMRA (Figura complementaria 11b, c). La mayoría de los clones expandidos reactivos con vimentina citrulinada o H3 se ubicaron en el grupo 0, y las células expandidas clonalmente expresaron altos niveles de GZMB, IFNG y MKI67 (Fig. 5d–f), consistente con los hallazgos en la Fig. 3.

Identificación de células sinoviales de AR con alta similitud transcripcional con sangre reactiva al antígeno citrulinado CD8⁺ células T

Para investigar si los clones reactivos con antígenos citrulinados identificados en la sangre con AR ACPA+ también podrían estar presentes en la membrana sinovial, realizamos un análisis de RNA-seq de una sola célula de 4 tejidos sinoviales y 3 muestras de sangre coincidentes de pacientes con AR ACPA+. Identificamos poblaciones expandidas clonalmente de sangre y CD8 citotóxico sinovial⁺ Células T entre CD3 totales⁺ Células T con los grandes (miembros del linaje clonal, 1 a‰§â€‰X > 0.01), medio (0.01 a‰§â€‰X > 0.002), y pequeño (0.002 a‰§â€‰X > 0.001) o singleton (0.001 a‰§â€‰X > 0) (Figura complementaria 12a, b). La mayoría de las células expandidas clonalmente estaban en la misma población de sangre y tejidos sinoviales y estas poblaciones expandidas clonalmente de sangre y CD8 sinovial⁺ Las células T expresaron altos niveles de GZMB y GNLYdefiniendo el CD8 citotóxico reactivo al antígeno citrulinado expandido⁺ linajes en sangre RA (Fig. 12c complementaria). En contraste, la mayoría GZMK⁺ Las células en la sangre y el sinovio de la AR se encontraban en distintas poblaciones con la GZMB⁺ GNLY⁺ células a pesar de que algunas de GZMK⁺ Las células también expresaban GZMB (Fig. 12c complementaria).

A continuación, utilizamos el análisis TCR emparejado para determinar si los clonotipos compartidos en la sangre y el sinovio exhiben un fenotipo transcriptómico citotóxico similar, que incluye GZMB o GZMK expresión. Seleccionamos los mejores clonotipos de tejido sinovial de dos pacientes con AR ACPA+ representativos y los combinamos los clonotipos a sangre de los mismos pacientes. Como se muestra en la Fig. 5g, encontramos que los clonotipos más expandidos de los tejidos sinoviales también están presentes en la sangre compatible en ambos pacientes. Además, mostramos estos CD8 expandidos clonalmente⁺ Las células T en la sangre y el sinovio exhibieron una gran similitud de los programas transcripcionales, incluida la expresión de los marcadores citotóxicos. GZMB, GZMK o GNLY (Figura 5h). Curiosamente, los clonotipos expandidos expresaron específicamente GNLY en el GZMB⁺ células, mientras GZMK⁺ Las células mostraron una menor expresión de GNLYsugiriendo que GZMB⁺ CD8⁺ Las células T tienen una función citotóxica en la membrana sinovial de la AR.

Observamos que la mayoría de los clonotipos compartidos en sangre y sinovial expresaron altos niveles de GZMB y GNLY (Fig. 13a-c complementaria), mientras que un número limitado de clonotipos compartidos coexpresaron GZMB y GZMK pero no GNLY (Fig. 13d complementaria). Por lo tanto, estos resultados sugieren que el citotóxico sensible al antígeno citrulinado GZMB⁺ GNLY⁺ los clonotipos en sangre también están presentes en la membrana sinovial ACPA+ RA.

Los antígenos citrulinados activan ACPA+ RA CD8⁺ Células T para producir mediadores citotóxicos

A continuación, buscamos examinar la capacidad citotóxica de ACPA + RA CD8 estimulado por antígeno citrulinado.⁺ células T Estimulamos sangre entera fresca de ACPA+ RA o HC con cit-vimentina o vimentina nativa durante 6 h, y medimos la expresión de CD69, GzmB e IFNγ en CD8⁺ y CD4⁺ Células T por citometría de flujo. La estimulación cit-vimentina aumentó significativamente la proporción de CD69⁺CD8⁺ y GzmB⁺IFNγ⁺CD8⁺ Células T de sangre ACPA+ RA en comparación con ningún tratamiento o estimulación con vimentina nativa (Fig. 6a). Por el contrario, la sangre HC no mostró reactividad a la cit-vimentina. Las sangres ACPA+ RA y HC exhibieron CD8⁺ Respuestas de células T a proteínas virales (Fig. 6a). Se observaron resultados similares para los CD4 productores de IFNγ⁺ Células T (Fig. 6a).

Evaluamos si otros antígenos citrulinados inducen la activación de CD8⁺ Células T en PBMC ACPA+ RA. Estimulamos las PBMC ACPA+ RA con 100 M de proteínas citrulinadas individuales, incluidas cit-vimentina, cit-fibrinógeno, cit-α-enolasa, cit-H2B, cit-H3 o cit-H4; o una mezcla de las 6 proteínas citrulinadas cada una a 20 μM; o una mezcla de las 6 proteínas nativas cada una a 20 M; y midió la expresión de IFNγ y GzmB por CD8⁺ Células T por citometría de flujo. Cit-vimentina, cit-α-enolasa y cit-H3 estimularon significativamente ACPA+ RA CD8⁺ Células T para expresar IFNγ y/o GzmB, en comparación con la estimulación con proteínas nativas o ningún tratamiento (Fig. 6b y Fig. 14a complementaria).

Mostramos la frecuencia de IFNγ⁺ y GzmB⁺IFNγ⁺ CD8⁺ Las células T aumentaron en respuesta a cit-vimentina de una manera dependiente de la concentración, mientras que la vimentina nativa o ningún tratamiento no activaron tal respuestas (Fig. 6c y Fig. 14b complementaria). El bloqueo mediado por anticuerpos del complejo CD8-HLA clase I inhibió la estimulación mediada por antígeno citrulinado de la expresión de IFNγ y/o GzmB por parte de CD8⁺ Células T (Fig. 6d y Fig. 14c complementaria). Por el contrario, ACPA− RA y HC CD8⁺ Las células T no fueron activadas por estas proteínas citrulinadas (Fig. 15a, b complementarias). Estimulación con ACPA+ RA CD8 inducido por cit-H3⁺ Las células T para expresar mediadores citotóxicos y el bloqueo de CD8 o el complejo HLA de clase I inhibieron esta respuesta (Fig. 16 complementaria), lo que demuestra la activación de anti-cit-H3 CD8⁺ Las células T también dependen de la presentación HLA clase I de cit-H3.

Los antígenos citrulinados estimulan ACPA+ RA CD8⁺ Células T para mediar la actividad citotóxica

Para determinar si CD8 reactivo con citrulina⁺ Los mediadores citotóxicos que expresan células T median la actividad citolítica, medimos la expresión de CD107a, un marcador expresado durante la secreción de gránulos líticos. Estimulación de ACPA+ RA CD8⁺ Las células T con cit-vimentina o cit-H3 provocaron significativamente el proceso de desgranulación medido por la expresión de CD107a (Figura complementaria 17a, b). Los anticuerpos bloqueantes anti-CD8 y anti-HLA clase I inhibieron la expresión de cit-vimentina o CD107a inducida por H3 (Fig. 17a, b complementarias). A continuación, probamos la capacidad de los antígenos citrulinados para activar ACPA+ RA CD8⁺ Células T para mediar en la muerte celular. Cit-vimentina, pero no nativa-vimentina, estimulada ACPA+ RA CD8⁺ Las células T mataron significativamente las células tumorales DLD-1 (Fig. 17c complementaria). Por el contrario, HC CD8⁺ Las células T no se activaron con cit-vimentina para mediar en la muerte citotóxica, pero mediaron en la muerte cuando se estimularon con una mezcla de NP de influenza viral y CMV pp65 (Fig. 17d complementaria). Juntos, estos resultados demuestran que los antígenos citrulinados pueden activar ACPA+ RA CD8⁺ Células T para mediar la citotoxicidad.